干旱在世界范圍內造成了嚴重的作物損失，預計氣候變化將在未來增加其發生率。與許多作物的情況類似，參考植物擬南芥Arabidopsis thaliana (Ath)被認為對干旱敏感，而正如我們所證明的，其近親擬南芥Arabidopsis lyrata (Aly)和 Eutrema salsugineum(Esa)具有抗旱性。為了了解這種可塑性的分子基礎，我們使用發育匹配的植物進行了深入的表型、生化和轉錄組比較。證明 Aly 通過早期生長減少、代謝適應和信號網絡重新布線對減少的可用水量做出最敏感的反應。相比之下，高基礎脯氨酸水平、ABA 信號轉錄和晚期生長反應證明了 Esa 處于不斷準備的模式。對壓力敏感的 Ath 的反應晚于Aly，早于Esa，盡管它的反應往往更為。所有物種都以相似的敏感性檢測缺水；響應差異編碼在下游信號和響應網絡中。此外，在 Aly 和 Esa 中以較高基礎水平表達的幾種信號基因已被證明在Ath中過度表達時可提高水分利用效率和抗旱性。我們的數據展示了密切相關的十字花科實現抗旱的對比策略。

圖1.擬南芥(Ath)、擬南芥(Aly)和Eutrema salsugineum (Esa) 的生長階段進展和抗旱性

作為了解十字花科干旱脅迫反應的重要第一步，對干旱敏感的Ath及其據報道更具抗性的近親Aly和Esa進行了對照比較研究。比較干旱研究的關鍵是需水量對發育參數的依賴性。由于物種之間的發育時間不同，首先定義了土壤生長的 Ath、Aly 和 Esa 植物的發育進程。在 WW 條件下，Ath 遵循先前描述的時間線，而 Aly 和 Esa 的葉子出現較慢（圖1a）。這種差異從發芽到第三片葉子的出現（階段 1.03）最為明顯，隨后更加同步（圖 1a）。對于生理和發育的可比性，使用 1.06 階段的植物作為起點，Ath 在 14 DAS 時達到，Aly 在 22 DAS 時達到，Esa 在 22 DAS 時達到。對于每個物種，使用 WIWAMxy 表型平臺種植、澆水和成像 128 株植物。在發育階段 1.06 (T0)，WD 子集連續 15 天 (T0-T14) 停止澆水。在 T14 WD 植物出現萎蔫的視覺跡象并重新澆水以確定存活率作為抗旱性的量度。幾乎所有 Aly 和 Esa 個體都康復了，分別對應于 96% 和 98% 的存活率；只有 76% 的 Ath 植物在嚴重干旱期間存活（圖 1b）。

圖2.充分澆水(WW)和缺水(WD) 條件下的玫瑰花結生長動態

根據預測玫瑰花結面積（PRA）確定了隨時間的增長。盡管這三個物種都對水資源利用率的降低做出了反應，花環生長也減少了，但它們的動態卻有很大的不同。Aly在T3時首先對缺水作出反應，而Ath和Esa僅在T5和T6時表現出顯著的生長減少（圖2a-c）。而在治療的第一天（T0），Aly PRA（211 mm2）明顯大于Esa（94 mm2）和Ath（100 mm2）。然而，較大的Aly花環在停止澆水后并沒有導致較高的耗水量（圖2d），這可能是生長減少較快的原因。生長減少時測得的土壤含水量分別為1.76（Aly）、1.66（Ath）和1.50（Esa）（圖2d）。因此，盡管預期這三個物種都會因水分利用率的降低而出現生長減少的反應，但與敏感的Ath相比，這兩個抗性物種明顯表現出相反的反應動力學。這種不同的反應可能表明，盡管Aly和Esa在進化上很接近，但它們在抗應激方面進化出了不同的策略。

為了更好地了解生長減少的基礎，我們更詳細地分析了葉片大小。在WD條件下，除子葉和晚出葉外，所有物種（L1-L11）的葉面積均顯著減少（圖3a-c）。這種增長減少在 Aly 中最為顯著（60%），而在 Ath 和 Esa 中分別減少了 42% 和 44%。值得注意的是 Aly 葉子的快速強響應，例如 Aly L1 的表面積減少了 42%，而 Esa 和 Ath 中 L1 的表面積分別減少了 13% 和 23%。成熟 L6 的細胞分析表明，細胞大小和細胞數量在 Ath 中減少到相似的程度。在 Aly 中，細胞數量（即增殖）的減少最為顯著，而在 Esa 中，細胞大小（即生長）受到的影響最為顯著（圖 3d、e）。細胞面積和數量的減少導致所有物種的細胞密度更高（圖 3f），而氣孔指數僅因干旱而略微降低。所有三個物種的氣孔面積在干旱時同樣減少，而氣孔密度的增加在 Aly 植物中更為顯著。這些觀察結果進一步證明了 Aly 和 Esa 表現出不同的干旱響應現象。

圖3.充分澆水(WW)和缺水(WD) 植物的葉和細胞參數

在有針對性的分析之后，我們的目標是采用無偏見的系統方法來使用WGCNA 分析分子干旱響應。將基因集與高度相關的特征基因（Pearson 相關系數 > 0.9）合并后，定義了28個網絡模塊并進行了顏色標記。八個模塊的表達模式與干旱處理顯著相關，因此可能代表脅迫反應的不同特征（圖4a-c）。在這八個模塊中，只有一個與兩種抗性物種相關（圖 7b），但與 Aly 負相關，與Esa正相關。

圖4.表達互正交（EMOs）的聚類分析

干旱在世界范圍內造成了嚴重的作物損失，預計氣候變化將在未來增加其發生率。與許多作物的情況類似，參考植物擬南芥Arabidopsis thaliana (Ath)被認為對干旱敏感，而正如我們所證明的，其近親擬南芥Arabidopsis lyrata (Aly)和 Eutrema salsugineum(Esa)具有抗旱性。為了了解這種可塑性的分子基礎，我們使用發育匹配的植物進行了深入的表型、生化和轉錄組比較。證明 Aly 通過早期生長減少、代謝適應和信號網絡重新布線對減少的可用水量做出最敏感的反應。相比之下，高基礎脯氨酸水平、ABA 信號轉錄和晚期生長反應證明了 Esa 處于不斷準備的模式。對壓力敏感的 Ath 的反應晚于Aly，早于Esa，盡管它的反應往往更為。所有物種都以相似的敏感性檢測缺水；響應差異編碼在下游信號和響應網絡中。此外，在 Aly 和 Esa 中以較高基礎水平表達的幾種信號基因已被證明在Ath中過度表達時可提高水分利用效率和抗旱性。我們的數據展示了密切相關的十字花科實現抗旱的對比策略。

圖1.擬南芥(Ath)、擬南芥(Aly)和Eutrema salsugineum (Esa) 的生長階段進展和抗旱性

作為了解十字花科干旱脅迫反應的重要第一步，對干旱敏感的Ath及其據報道更具抗性的近親Aly和Esa進行了對照比較研究。比較干旱研究的關鍵是需水量對發育參數的依賴性。由于物種之間的發育時間不同，首先定義了土壤生長的 Ath、Aly 和 Esa 植物的發育進程。在 WW 條件下，Ath 遵循先前描述的時間線，而 Aly 和 Esa 的葉子出現較慢（圖1a）。這種差異從發芽到第三片葉子的出現（階段 1.03）最為明顯，隨后更加同步（圖 1a）。對于生理和發育的可比性，使用 1.06 階段的植物作為起點，Ath 在 14 DAS 時達到，Aly 在 22 DAS 時達到，Esa 在 22 DAS 時達到。對于每個物種，使用 WIWAMxy 表型平臺種植、澆水和成像 128 株植物。在發育階段 1.06 (T0)，WD 子集連續 15 天 (T0-T14) 停止澆水。在 T14 WD 植物出現萎蔫的視覺跡象并重新澆水以確定存活率作為抗旱性的量度。幾乎所有 Aly 和 Esa 個體都康復了，分別對應于 96% 和 98% 的存活率；只有 76% 的 Ath 植物在嚴重干旱期間存活（圖 1b）。

圖2.充分澆水(WW)和缺水(WD) 條件下的玫瑰花結生長動態

根據預測玫瑰花結面積（PRA）確定了隨時間的增長。盡管這三個物種都對水資源利用率的降低做出了反應，花環生長也減少了，但它們的動態卻有很大的不同。Aly在T3時首先對缺水作出反應，而Ath和Esa僅在T5和T6時表現出顯著的生長減少（圖2a-c）。而在治療的第一天（T0），Aly PRA（211 mm2）明顯大于Esa（94 mm2）和Ath（100 mm2）。然而，較大的Aly花環在停止澆水后并沒有導致較高的耗水量（圖2d），這可能是生長減少較快的原因。生長減少時測得的土壤含水量分別為1.76（Aly）、1.66（Ath）和1.50（Esa）（圖2d）。因此，盡管預期這三個物種都會因水分利用率的降低而出現生長減少的反應，但與敏感的Ath相比，這兩個抗性物種明顯表現出相反的反應動力學。這種不同的反應可能表明，盡管Aly和Esa在進化上很接近，但它們在抗應激方面進化出了不同的策略。

為了更好地了解生長減少的基礎，我們更詳細地分析了葉片大小。在WD條件下，除子葉和晚出葉外，所有物種（L1-L11）的葉面積均顯著減少（圖3a-c）。這種增長減少在 Aly 中最為顯著（60%），而在 Ath 和 Esa 中分別減少了 42% 和 44%。值得注意的是 Aly 葉子的快速強響應，例如 Aly L1 的表面積減少了 42%，而 Esa 和 Ath 中 L1 的表面積分別減少了 13% 和 23%。成熟 L6 的細胞分析表明，細胞大小和細胞數量在 Ath 中減少到相似的程度。在 Aly 中，細胞數量（即增殖）的減少最為顯著，而在 Esa 中，細胞大小（即生長）受到的影響最為顯著（圖 3d、e）。細胞面積和數量的減少導致所有物種的細胞密度更高（圖 3f），而氣孔指數僅因干旱而略微降低。所有三個物種的氣孔面積在干旱時同樣減少，而氣孔密度的增加在 Aly 植物中更為顯著。這些觀察結果進一步證明了 Aly 和 Esa 表現出不同的干旱響應現象。

圖3.充分澆水(WW)和缺水(WD) 植物的葉和細胞參數

在有針對性的分析之后，我們的目標是采用無偏見的系統方法來使用WGCNA 分析分子干旱響應。將基因集與高度相關的特征基因（Pearson 相關系數 > 0.9）合并后，定義了28個網絡模塊并進行了顏色標記。八個模塊的表達模式與干旱處理顯著相關，因此可能代表脅迫反應的不同特征（圖4a-c）。在這八個模塊中，只有一個與兩種抗性物種相關（圖 7b），但與 Aly 負相關，與Esa正相關。

圖4.表達互正交（EMOs）的聚類分析